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如何获取高质量显微镜图像

发布时间:2016-10-12 14:57 |  点击次数:

 

如何获取高质量的显微镜照片
作者:Bonnie Marsick    September 23, 2016 翻译 裕恒丰科技有限公司
         在原代细胞培养过程中,一张好的照片胜过千言万语。优质的照片可以传递细胞的形态、健康状况、纯度和密度。如果同时使用不同类型的2维显微镜技术,如相差、浮雕对比和荧光显微镜等,可以为你所培养的细胞提供有价值的认识。
       相差显微镜通过将细胞的厚度转化成灰度级,增强了对比度。细胞的较厚区域,如细胞核,比细胞浆等较薄的区域更暗。这种技术对于评估细胞形态和培养中的纯度观察很有用。它也可以指明细胞的健康状态,如细胞质变暗,提示细胞可能受损或死亡。 图1相差显微镜下人的角质细胞、内皮细胞和成纤维细胞形态的不同之处。
        浮雕对比度显微镜(也称为霍夫曼调制对比)呈现了一个阴影伪浮雕效果,它也可以用来评估培养的细胞的形态和纯度。 它特别有助于区分那些不同的细胞类型,如更扁平的细胞(如成纤维细胞)与更厚的、更圆的细胞(如上皮细胞)。如图2所示。
       与此相反,荧光显微镜使用紫外(UV)光激发/发射滤波器选择性地激发和显示荧光。它可用于观察荧光蛋白的细胞或免疫荧光染色的结果。免疫荧光染色使用荧光标记的抗体与目的蛋白特异性结合,可用于检测细胞的特异性标记物,这也是评估培养细胞纯度的最佳方法之一。图3演示了如何用免疫荧光染色鉴定细胞类型和培养纯度。第1张图显示了几个β-tubulin III阳性的神经元在两个 DAPI阳性细胞核(红色箭头)的非神经元细胞中间。第2张 HUVEC图像显示的是一个纯度很高的培养细胞,广泛的表达内皮细胞的标志物CD31。第3张图像为人类星形胶质细胞,纯度也很高,标志物GFAP阳性染色分布广泛。
       虽然这些显微镜技术提供了不同方面的信息,联合使用这三种显微镜技术来观察你所培养的细胞状态和纯度,是获取细胞状态的有效方法。

拍摄高质量图片的技巧
       为了获取高质量和真实的显微镜图片,这些基本要素需要被考虑:显微镜配置,焦距和曝光。
                      显微镜的配置
      首先要充分了解显微镜的使用情况。如果是新手,要请有经验的人示范正确的使用方法,或是在使用前认真阅读说明书。显微镜有许多可移动部件,哪怕其中一处设置错误,都可能会影响所拍摄图片的质量。熟练掌握显微镜的不同设置,并能根据需要选择合适的光路,将大大有助于解决使用过程中可能遇到的各种问题。
                      焦距
       清晰的焦点是好图像的最重要特点,但却并不容易实现。虽然细胞在体外通常生长在二维表面上,但实际上细胞是三维的。 那应该聚焦在细胞的哪个区域呢? 对于使用相差和浮雕对比相差这类利用透射光线来观察整个细胞,通常理想的状态是聚焦在最薄的部分(图4A)而不是在胞体上(图4B)。为了做到这一点,可以一边观察细胞边缘,一边调整微调旋钮,直到边缘变得锐利。在荧光图像中,在核染色(通常是蓝色的Hochst或DAPI)窗进行聚焦,同时比细胞浆或粘附蛋白的聚焦效果好。 聚焦后再用每种颜色进行微调,能确保感兴趣的颜色区域是锐利的。 这将保证一旦颜色被合并,能得到完全清晰的图像。
                      曝光
         曝光与图像中所能捕获的光的强度相关。对于相差和浮雕对比度的控制,可以通过调节透射灯的强度,或在软件中调整曝光时间来实现。过强的曝光会导致图片饱和度过高或过于明亮,从而缺少光强的变化(图5)。而太低的曝光将难以显现细胞(图5)。细胞培养测试。
培养基内毒素不超过0.625 EU / ml,且无病毒成分。



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